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Physique du cytosquelette et fonctions membranaires

Chef d'équipe : François Amblard

Physique du cytosquelette et fonctions membranaires

Contrôle dynamique des processus intracellulaires


Le décryptage des processus cellulaires repose sur la notion de rapport entre structure et fonction, qui ne permet pas facilement de prendre en compte le fait que les objets vivants sont hors équilibre. Avec la physico-chimie du cytosquelette comme point de départ, notre équipe travaille depuis sa création à l'exploration quantitative de la dynamique du cytosquelette à l'œuvre dans les processus d'auto-assemblage et de maintenance de l'architecture cellulaire. Cherchant à comprendre les rapports entre dynamique et fonction, nos travaux actuels portent plus particulièrement sur le rôle de la dynamique dans deux phénomènes fonctionnant en sens opposés : une instabilité dynamique à l'origine du mouvement cellulaire, et la stabilisation dynamique des épithéliums.

L'amibe entameoba histolytica est filmée en microscopie par contraste de phase. Elle émet des protrusions membranaires, causées par un détachement brutal entre la membrane et la cytosquelette sous-jacent, sous l'effet d'une pression interne excessive résultant de la contraction permanente du cortex d'actine. Le décrochement de la membrane conduit ensuite à l'effondrement local du cytosquelette, à la formation d'un nouveau cortex qui se stabilise, et finalement à la répétition cyclique de l'ensemble des étapes. Cette instabilité du cortex est nécessaire à la motilité de cette amibe, et à son pouvoir infectieux.



Nous abordons ces questions grâce à la pluridisciplinarité de notre équipe -physiciens, biologistes et médecins - et à l'aide des techniques de biologie cellulaire et moléculaire, d'imagerie, de spectroscopie, de micromanipulation, de photo-manipulation, et de modélisation.

D'une part, nous étudions la motilité cellulaire dite "ameboïde", qui s'avère résulter d'une instabilité finement contrôlée du cytosquelette sous-membranaire. Par la combinaison de l'expérience et de la théorie, nous étudions le mécanisme physique de cette instabilité dynamique, et nous espérons ainsi simplifier l'étude des voies de régulation de cette motilité cellulaire impliquée dans la migration de cellules cancéreuses dans les tissus "mous". Nous cherchons aussi à comprendre comment est choisi le mode de migration, ameboïde ou mésenchymateux, mis en œuvre par les cellules cancéreuses ou immunocompétentes.

D'autre part, considérant que la stabilité mécanique des épithéliums requiert l'équilibre des forces transmises via les jonctions cellulaires, nous avons postulé que l'équilibre entre cellules adjacentes ne peut pas être réalisé de façon statique, mais nécessite la correction permanente d'un déséquilibre entre forces intercellulaires. Ce postulat donne un rôle central à la dynamique du cytosquelette et des structures d'adhésion intercellulaire dans l'homéostasie géométrique des tissus. Il implique également un contrôle mécanosensible des processus de renouvellement du cytosquelette. Ainsi, le désordre histologique observé aux premiers stades de la transformation tumorale serait le fruit d'une dynamique anormale des processus de stabilisation. La première étape de notre travail a porté sur la dynamique de renouvellement de la E-cadhérine, le rôle de l'endocytose et le lien entre dynamique et stabilité tissulaire.
Fig1: Endocytose de la E-cadhérine est la condition nécessaire de son désengagement des liaisons adhésives. Comme elle intervient de façon continue, les liaisons ont une durée de vie courte -quelques minutes. En présence d'un inhibiteur de l'endocytose (c,d), la E-cadhérine (fusion GFP, a,b,c,d) reste indéfiniment engagée, et les vésicules d'endocytose (récepteur transferrine, rouge, b,d) ne se forment plus.Fig1: Endocytose de la E-cadhérine est la condition nécessaire de son désengagement des liaisons adhésives. Comme elle intervient de façon continue, les liaisons ont une durée de vie courte -quelques minutes. En présence d'un inhibiteur de l'endocytose (c,d), la E-cadhérine (fusion GFP, a,b,c,d) reste indéfiniment engagée, et les vésicules d'endocytose (récepteur transferrine, rouge, b,d) ne se forment plus.

Nos résultats signalent par ailleurs une corrélation claire entre la déstabilisation de l'épithélium via l'oncogène c-Met et une dynamique accélérée des cadhérines. L'endocytose, processus nécessaire à la dissociation des interactions adhésives -probablement sous contrôle mécanosensible- semble jouer un rôle-clé. À partir de ces résultats, nous souhaitons caractériser le désordre histologique de façon quantitative et étudier la réponse d'une jonction à une perturbation asymétrique, et nous étudierons plus généralement la propagation ou la suppression du phénotype tumoral à partir d'une activation oncogénique locale.

Spectroscopie de la mélanine, et applications médicales


La microscopie optique multiphotonique, pratiquée dans l'équipe depuis sa création, est maintenant largement mise au service de nos collègues à travers de nombreuses collaborations.
Fig2.Amblard: Microstructures 3D formées par photopolymérisation induite à deux photons. En déplaçant dans l'espace le point de focalisation, où est restreint l'effet d'absorption biphotonique, des formes arbitraires peuvent être construites, adaptées géométriquement, mecaniquement et chimiquement pour la culture de cellules.Fig2.Amblard: Microstructures 3D formées par photopolymérisation induite à deux photons. En déplaçant dans l'espace le point de focalisation, où est restreint l'effet d'absorption biphotonique, des formes arbitraires peuvent être construites, adaptées géométriquement, mecaniquement et chimiquement pour la culture de cellules.

Cet outil nous a permis d'observer une propriété inattendue des mélanosomes, pigments de la peau composées de mélanine condensée sous forme de solide. L'excitation des mélanosomes par une source laser femtoseconde fait apparaître un seuil d'intensité au-delà duquel la fluorescence relativement faible de la mélanine est dominée par une luminescence très intense. De tels effets de seuil sont inconnus dans le domaine de la spectroscopie des biomolécules. La mélanine étant un semiconducteur, nous avons cherché à comprendre la physique de ce phénomène avec l'hypothèse d'une transition optique apparentée à un microlaser. À l'aide de plusieurs outils de spectroscopie -analyse spectrale et temporelle, formatage de trains d'impulsion- nous avons découvert l'origine thermique de cette luminescence, due à la structure de solide riche en carbone sp2. Nous poursuivrons l'étude fondamentale de ce rayonnement, notamment dans le domaine infrarouge proche, mais travaillons d'ores et déjà sur l'exploitation clinique de cette découverte. En effet, la luminescence photoinduite des mélanosomes est à la fois intense et très spécifique, et nous souhaitons l'exploiter comme une signature nouvelle pour l'imagerie des marges opératoires de mélanomes. Nous projetons également d'utiliser cette propriété pour dénombrer et identifier les cellules porteuses de métastases parmi les cellules mélanocytaires circulant dans le sang périphérique. Grâce à la présence d'une clinicienne dans l'équipe, ces développements se font en collaboration étroite avec l'hôpital.

Perspectives


Nous souhaitons vivement renforcer nos liens avec les problématiques médicales, qui ont déjà beaucoup infléchi nos pistes de recherche sur le plan fondamental. Nous poursuivons l'étude de la spectroscopie des mélanosomes, ainsi que son exploitation médicale. En imagerie, la validation clinique de la microscopie confocale de réflectance pour le diagnostic des mélanomes nous a conduit à proposer une consultation spécialisée pour patients à haut risque, et nous projetons, en collaboration avec le département de chirurgie, de valider l'imagerie macro/microscopique par balayage laser pour contrôler les marges d'exérèse.
Sur le plan fondamental, le travail engagé sur l'origine de la stabilité des épithéliums et du désordre dysplasique fait naître une question centrale : dans quelle mesure les causes génétiques aujourd'hui associées à une transformation tumorale -activation d'un oncogène par exemple-, conduisent-elles ou non à un développement tumoral si on les introduit localement dans une ou quelques cellules seulement, dans un voisinage cellulaire initialement intact. Cette question, en rapport avec la notion de suppression phénotypique, nous incite à étudier les effets collectifs de contrôle mutuel entre cellules dans un tissu. À l'aide des concepts de transition de phase, et d'outils dont nous disposons -microfabrication 3D, photoactivation locale d'oncogènes, quantification du désordre histologique- nous espérons comprendre ce qui conditionne, dans la collectivité des cellules, la nucléation et les premières étapes du développement tumoral.